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本试剂盒采用特殊设计的DNA探针与核糖体RNA(rRNA)杂交，随后利用Ribo RNase H降解DNA-rRNA杂交链中的rRNA，从而去除人、小鼠、大鼠总RNA中的细胞质核糖体RNA(28S、18S、5.8S、5S)和线粒体内核糖体RNA(16S、12S)，保留信使RNA(mRNA)和其它非编码RNA。

本试剂盒对于完整和部分降解的总RNA(如FFPE RNA)均具有良好的rRNA去除效果，所获得的去除了rRNA的RNA样本可用于mRNA和非编码RNA高通量测序，可显著提高测序结果中有效数据比例，纯化产物也可用于随机引物cDNA合成或其它下游应用。

• 样本广泛：适用于高质量（完整）及部分降解（如FFPE）样本中rRNA的去除。
  
• 高效去除：有效去除95～99.9%的人/小鼠/大鼠的rRNA。
  
• 数据全面：保留了不完整mRNA和非编码RNA信息，使转录组数据更加全面。
  
• 快速评估：试剂盒中提供的引物可快速评估rRNA的去除效果。

• 操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
  
• 请使用不含RNase或DNase的枪头、离心管进行实验。
  
• 实验开始前，请清洁操作台，建议使用RNA酶及DNA酶清除试剂处理台面。确保没有RNase和DNase的污染。

• 去除rRNA的RNA纯化：RNA纯化磁珠(货号：WH0307)。
  
• PCR检测rRNA去除效率，反转录试剂盒(货号：WH0234)，染料法Real-Time PCR预混液(货号：WH0103)。

• 在200μL Nuclease-Free PCR管中，用RNase-Free ddH2O将100～1000ng人/小鼠/大鼠的总RNA稀释至9μL，冰上放置备用。
  
  • 总RNA样品中应无DNA、盐离子(例如Mg²⁺、胍盐)、有机试剂(例如酚、乙醇)残留，否则可能导致非预期的RNA降解或去除效率降低。
• 参照下表配制探针反应液：
  

  成分	用量
  5×Hybridization Buffer	3μL
  Ribo Hybridization Probe(H/M/R)	3μL

• 将步骤2的6μL探针反应液加入到步骤1装有9μL RNA样品的PCR管中，用移液器吸吹混匀10次。
  
• 瞬时离心，将样品置于PCR仪中(启用热盖99～105℃均可)，按以下程序操作，总共耗时约20min。
  

  步骤	温度	时间
  1	95℃	2min
  2	95～37℃	0.1℃/sec
  3	37℃	5min hold

  • 必须慢速降温(每秒降温0.1℃)，使探针与rRNA充分杂交。

• 参照下表在冰上配制Ribo RNase H反应液，并用移液器吸吹混匀10次。
  

  成分	用量
  10×Ribo RNase H Buffer	2μL
  Ribo RNase H	3μL

• 将5μL Ribo RNase H反应液加入步骤一的产物中，构成20μL反应体系，用移液器吸吹混匀10次。
  
• 瞬时离心，将样品置于PCR仪中(启用热盖40℃)，37℃孵育30min。
  
• 瞬时离心，将样品置于冰上，立即进入下步操作。

• 参照下表在冰上配制Ribo DNase I反应液，并用移液器轻轻吸吹混匀10次。
  

  成分	用量
  RNase-Free ddH2O	22μL
  10×DNase I Buffer	5μL
  Ribo DNase I	3μL

• 将30μL Ribo DNase l反应液加入步骤二的产物中，构成50μL反应体系，用移液器吸吹混匀10次。
  
• 瞬时离心，将样品置于PCR仪中(启用热盖40℃)，37℃孵育30min。
  
• 瞬时离心，将样品置于冰上，立即进入下步操作。

• 涡旋振荡混匀RNA纯化磁珠，吸取110μL(2.2倍体积)至步骤三的50μL RNA产物，用移液器吸吹混匀10次。
  
• 室温静置15min，使RNA充分结合到磁珠上。
  
• 将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，用移液器小心移除上清。
  
• 保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠(不要吹散磁珠)，室温孵育30sec，小心移除上清。
  
  • 每次实验需要新鲜配制80%乙醇，因为乙醇易从空气中吸收水分，浓度降低影响实验效果。
• 重复步骤4进行漂洗。
  
• 取出离心管短暂低速离心(＜2000g,10sec)，使液体收集至管底，将样品放回磁力架，用移液器小心弃去所有液体。
  
• 保持样品始终处于磁力架上，开盖晾干磁珠3～5min。
  
  • 不要过度干燥，否则可能降低RNA回收率。洗脱应当在磁珠依然显深棕色且光亮，而且所有可见液体已完全挥发时进行。若磁珠出现裂缝，则表示已过度干燥。
• 将样品从磁力架上取出，加入6.5μL RNase-Free ddH2O，用移液器吹打10次混匀磁珠，室温静置2min。
  
  • 上述洗脱体积适用于RNA文库构建试剂盒(货号：WH0292、WH0293)，如搭配其他RNA建库产品，请根据产品说明书选择合适的洗脱体积。
• 在磁力架上静置2min，待溶液澄清后，不要触动磁珠，小心吸取5μL上清至新的Nuclease-Free PCR管。
  
  • 可根据步骤8选择的实际洗脱体积进行相应调整，尽量充分利用洗脱产物。
• 洗脱样品可立即用于RNA测序文库构建或其他分析应用，也可在-20℃保存过夜或在-80℃保存30天。

本试剂盒提供两对定量PCR引物，分别为18S rRNA的rRNA Primer Mix和beta-actin的mRNA Primer Mix。建议以不进行处理的等量初始总RNA为对照(需用RNase-Free ddH2O或洗脱缓冲液稀释至洗脱体积)，以评估rRNA去除效率和mRNA损失比例。

两步法示例：逆转录用1μL的RNA产物作模板，合成第一链cDNA，然后定量PCR用2μL cDNA作模板。试剂盒使用反转录试剂盒和染料法Real-Time PCR预混液。

• 逆转录反应
  
  • 参照下表在冰上配制逆转录反应液：
    

    成分	用量
    RNase-Free H2O	12μL
    5×gDNA Buffer	2μL
    10×King RT Buffer	2μL
    FQ-RT Primer Mix	2μL
    Quicking RT Enzyme Mix	1μL
    RNA	1μL

  • 用移液器吸吹混匀并短暂离心，置于PCR仪中(热盖99～105℃)，42℃孵育15min，随后95℃孵育3min。
    
  • 取出瞬时离心，得到的cDNA可用于后续定量实验，或在-20℃保存。
• 定量PCR(以Bio-Rad CFX96为例)
  
  • 使用Nuclease-Free PCR管，参照下表在冰上配制定量PCR反应液：
    

    成分	用量
    2×SuperReal PreMix Plus	10μL
    50×ROX Reference Dye	0μL
    rRNA Primer Mix或mRNA Primer Mix	1μL
    cDNA模板	2μL
    RNase-free ddH2O	至20μL

  • 用移液器吸吹混匀并短暂离心。
    
  • 将各管反应样品置于定量PCR仪中，参照下表开始进行检测：
    

    阶段	循环	温度	时间	说明	荧光信号采集
    预变性	1×	95℃	15min	预变性	否
    PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
    		60℃	30sec	退火/延伸	是
    溶解曲线分析

    • 此处以Bio-Rad CFX96 Real Time System为例，其它定量PCR仪器请参照仪器使用说明书或染料法Real-Time PCR预混液说明书的建议。
• 供参考的两步法RT- PCR结果示例：
  

  引物	1μg RNA样品	Ct值
  		Human	Mouse	Rat
  rRNA Primer Mix	未经rRNA去除	9.26	7.41	8.12
  	经rRNA去除	28.87	26.95	27.22
  mRNA Primer Mix	未经rRNA去除	19.32	21.28	20.38
  	经rRNA去除	19.44	21.74	20.31
  rRNA去除率		99.9%	99.9%	99.9%

  去除率计算方法：
  

  去除率＝(1－	1	)×100%
  	2ΔCt

  
  ΔCt＝Ct_{(经rRNA去除)}－Ct_{(未经rRNA去除)}